本帖部分例题内容摘自：网上的发的王镜岩 主编，生物化学（上），高教出版社，2002，第三版的课后习题解答。谢谢解答者！我大致看了一下，把有错的地方给改过来了，连同楼上我摘录的张来群 等，生物化学习题集，科学出版社，2002，第一章的Lys-Lys-Lys的等电点计算，还有我自己写的“酒石酸缓冲溶液的配置（附录缓冲溶液的配制方法小结）”应对生物化学考研试题应该足够了。

（一） 氨基酸解离的pH计算的解题方法：

    基本方法是用Henderson-Hasselbalch方程，pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]，[共轭碱]表示共轭碱的摩尔浓度，pKa表示解离常数，大致知道： pKa（coo-）=3.2-3.6， pKa（NH+）=8.0-10.6,  记个大致数字即可，Lg是以10为底的对数。具体就两点：

    1.题设中是哪个基团解离就用那个基团的pK，其他深的东西这里不讲，讲多了反而乱。

    2.如果分不清共轭酸碱，那么更简单的规则：[共轭碱]/[共轭酸]=[质子受体]/[质子供体]=[氢离子离去后剩下的离子或者分子]/[带有氢离子的离子或为失去质子的分子]，请看例1的说明，注意分子和分母的对象（质子受体与质子供体）必须是一对共轭酸碱，也就是说两者除了相差1个或多个氢离子外其余部分没有两样！最简单的规则：缺质子的在分子，或者缺质子的在上面。

例1。计算赖氨酸的ε-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]（pKb = 10.53）

（原题录入有错，我根据课本原题修正了，这题的解答也有错，我重写了解答）

解：ε-NH+20%被解离，

    NH3+解离为NH2 + H+， NH3+和NH2+两者中谁的正电荷少，也就是丢掉的H+谁就在分子位置，ε-NH3+20%就是说有20%的ε-NH3+成为了ε-NH2，还剩下80%的ε-NH3+。

那么根据Henderson-Hasselbalch方程：

pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]

pH=[质子受体]/[质子供体]

pH=[氢离子离去后剩下的离子或者分子]/[带有氢离子的离子或为失去质子的分子]

pH=10.53+lg[ε-NH2]/[ε-NH3+]

pH = 10.53 + lg(0.25) 

pH = 10.53 -0.6020

pH =9.928

以上是我重写的解答。

网上原来的解答：

“pH = pKa + lg20%    

    pH = 10.53 + lg20% = 9.83”，lg20%不对！

例2.酒石酸缓冲溶液的配置（附录缓冲溶液的配制方法小结）

250mmol/LPH=3.0和50mmol/LPH=4.5的酒石酸溶液怎么配制？

（本题包括缓冲溶液的配制方法小结全部是由我直接解答）

解：酒石酸是二元酸，但是解离时基本上只考虑一级解离即可，也是用Henderson-Hasselbalch方程，

1）PH=3的250mmol/L的酒石酸缓冲溶液的配制方法：

d-酒石酸，pKa1=3.04；pKa2=4.37.
pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]

3=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]

lg[C(HA-)/C(H2A)]=-0.04

[C(H2A)/C(HA-)]=10^(0.04)=1.0964，

这也就是说只要是同样摩尔浓度的酒石酸溶液和酒石酸钠溶液 按等体积混溶就成为PH=3，你既然要250mmol/L的酒石酸缓冲溶液，那就先配出250mmol/L的酒石酸溶液和250mmol/L的酒石酸钠溶液等体积混溶均匀即可成为PH=3的250mmol/L的酒石酸缓冲溶液。

2）250mmol/L的PH=4.5的酒石酸缓冲溶液的配制方法：

pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]

4.5=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]

lg[C(HA-)/C(H2A)]=1.46

[C(HA-)/C(H2A)]=28.8403

    也就是[C(HA-)/C(H2A)]=29/1，即配制时取[酒石酸钠的物质的量(摩尔数)]/[ 酒石酸的物质的量(摩尔数)]=29/1.

    补充一点：缓冲溶液的配制方法小结：
1.用Henderson-Hasselbalch方程，pH=pKa+lg[C(HA-)/C(H2A)]，
算出共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的比例（摩尔数比例）。
2.对于多元弱酸，用Henderson-Hasselbalch方程，共轭酸变为共轭碱永远只取一级电离，也就是共轭碱(HA-)永远只带一个负电荷，因为二级解离要在一级解离的基础上，一般不必考虑。
3.对于多元弱酸，用Henderson-Hasselbalch方程，pKa永远取pKa1。
4.配制时比较简单的完整操作办法：将共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的总量定为1摩尔，并且共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的比例加以换算，是固体则换算成质量，是液体按其占有摩尔比换算成体积。
举例：以第三题为例
“250mmol/L的PH=4.5的酒石酸缓冲溶液的配制方法：
pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]
4.5=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]
lg[C(HA-)/C(H2A)]=1.46
[C(HA-)/C(H2A)]=28.8403
    也就是[C(HA-)/C(H2A)]=29/1，即配制时取[酒石酸钠的物质的量(摩尔数)]/[ 酒石酸的物质的量(摩尔数)]=29/1.”
    酒石酸钠的物质的量(摩尔数)+酒石酸的物质的量(摩尔数)=1mol溶质，
这1mol溶质中酒石酸钠的物质的量(摩尔数)是29/30mol，用29/30mol X “酒石酸钠的分子量”=所要的酒石酸钠的质量。
    酒石酸是液体，我们用在1mol 溶质中: 酒石酸的物质的量(摩尔数)-----也就是：1/30mol/“酒石酸溶液的摩尔浓度”=酒石酸所需的体积。“酒石酸溶液的摩尔浓度"是指你们实验室的现货酒石酸溶液的摩尔浓度，当然要比最终缓冲溶液浓度大，不然还要先浓缩。

    这样，1mol溶质中酒石酸钠和酒石酸就凑齐了，先把两者都放进1L的烧杯中，然后向里注蒸馏水直到总体积到达1L或略少，搅拌均匀，测定PH，可往里面加极少量的酒石酸钠或酒石酸把PH值跳到4.5. 如此，你就有了1L的1mol/L的PH=4.5酒石酸缓冲溶液，然后再稀释到250mmol/L，稀释过程不影响pH值。除非无限稀释，因为那时就要考虑的水的pKa了。

    当然，按250mmol溶质算酒石酸钠和酒石酸的用量，然后加蒸馏水定容至1L，不再稀释也可以。

（二）氨基酸和多肽的等电点（isoelectric point）的计算方法：

1.无论是一个氨基酸，还是N个氨基酸组成的多肽链的等电点计算，就是找氨基酸或者肽链的正电荷和负电荷正好相等的pH。

2.只要给定pH任何的可电离的基团的 pKa大，那么该可电离的基团就必须要交出一个正电荷，也就是氢离子。

3.根据而“（二）2”写出氨基酸或者多肽的解离方程，找出净电荷为零的分子形式，有关的pKa值，题目都会给出。净电荷为零的分子形式的pH值，即正电荷的pKa值+正电荷的pKa值的二分子之一就是等电点值。无论是多肽还是氨基酸都是如此。

4.一般.不使用enderson-Hasselbalch方程，即pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]，[共轭碱]。

例3。计算谷氨酸的γ-COOH三分之二被解离时的溶液pH。[4.6]

解：γ-COOH三分之二被解离时，质子受体(γ-COO-) 占 2/3，质子供体(γ-COOH)占 1/3.

    那么根据Henderson-Hasselbalch方程：

 pKa = 4.25

    pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]

    pH=pKa+[质子受体]/[质子供体]

    pH=pKa+[氢离子离去后剩下的离子或者分子]/[带有氢离子的离子或为失去质子的分子]

    pH=pKa+[质子受体(γ-COO-)]/[质子供体(γ-COOH)]]

    pH = pKa + lg[(2/3)/( 1/3)] 

    pH =4.25 +lg2

    pH =4.25+0.30

    pH =4.55

以上本题题解由我重新作出。原来的网上答案如下：

“pH = pKa + lg2/3%   

    pH = 4.25 + 0.176 = 4.426”，网上原来的答案不对！

例4. 将含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、亮氨酸(pI=6.53)和赖氨酸(pI=5.98)的柠檬酸缓冲液，加到预先同样缓冲液平衡过的强阳离交换树脂中，随后用爱缓冲液析脱此柱，并分别收集洗出液，这5种氨基酸将按什么次序洗脱下来？[Asp, Thr, Gly, Leu, Lys]

解：在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是减刑氨基酸(A2+)>中性氨基酸(A+)>酸性氨基酸(A0)。因此氨基酸的洗出顺序大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸，最后是碱性氨基酸，由于氨基酸和树脂之间还存在疏水相互作用，所以其洗脱顺序为：Asp, Thr, Gly, Leu, Lys。（这题直接从网上摘来，我看没有错也就没有编辑，谢谢解答者）

例5。根据氨基酸的pKa值（请自行查阅生物化学教材），计算下列氨基酸的pI值：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和精氨酸。[pI:6.02;5.02;3.22;10.76]

解：写出解离方程，找出净电荷为零的分子形式，有关的pKa值，题目都会给出，

  pI = 1/2（pKa1+ pKa2）

    pI(Ala) = 1/2（2.34+9.69）= 6.02

    pI(Cys) = 1/2（1.71+10.78）= 5.02

    pI(Glu) = 1/2（2.19+4.25）= 3.22

    pI(Ala) = 1/2（9.04+12.48）= 10.76

（这题直接从网上摘来，我看没有错也就没有编辑，谢谢解答者）

具体方法见：王镜岩 主编，生物化学（上），高教出版社，2002，第三版133-135页。

例6.三个lys连在一起，即三肽Lys-Lys-Lys的等电点如何计算？
解：这题不是我原创的，是张来群 等，生物化学习题集，科学出版社，2004，第二版，第4-5页上的。多肽Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离基团，等电点时侧链带正电，羧基带负电，由正负电荷相等每个侧链集团带1/3个正电荷(也就是[-NH2]/[-NH3+])
等电点：pH=pK3+lg([-NH2]/[-NH3+])
=10.53+lg([2/3]/[1/3])
=10.53+0.3
=10.83
Lys-Lys-Lys多肽的等电点比任何一个pK数值都高。

例7.

    计算多肽的等电点：丙氨酰丙氨酰赖氨酰丙氨酰（末端--COOH  pK=3.58，末端NH3+  pK=8.01，ε-NH3+  pK=10.58）。

   本题与解答摘自：陈俊辉 等，生物化学习题解析，科学出版社，2001，第二版，p48,p76,p77。

感谢原作者！为了说明清楚，我在原解答中加了一些说明文字。

解：Ala-Ala-Lys-Ala的解离情况如下所示：

(+Ala)-Ala-(Lys+)-Ala<--pH=3.58--->+Ala-Ala-(Lys+)-(Ala-)<---pH=8.01----->

Ala-Ala-(Lys+)-(Ala-)<------pH=10.58--->Ala-Ala-Lys-(Ala-)

    对于Ala-Ala-(+Lys)-(Ala-)，也就是溶液pH范围是：8.01<pH<10.58之间的时候，静电荷正好为零，为什么？因为此时Lysε-NH3+的pK=10.58，相对于溶液pH范围8.01<pH<10.5，此时Lysε-NH3+的pK大约溶液pH，此时Lysε-NH3+拒绝丢掉H+，所以Lysε-NH3+保持不变，净带了一个正电荷；与此同时，而相对于溶液pH范围8.01<pH<10.5，末端---NH3+  （位于Ala，位于哪个具体氨基酸不影响结果)pK=8.01，小于此时的溶液pH范围的下限，所以它只能交出一个H+，变成了---NH2，不带电了。可那个负电荷又从哪里来？别忘了末端--COOH（位于Ala，位于哪个具体氨基酸不影响结果)  pK=3.58，也小于此时的溶液pH范围的下限，也不得不交出一个一个H+，此时--COOH电离为--COO- ，也就是净带了一个负电荷。为了清楚但氨基酸残基有括号及带有电荷。

     所以，等电点形式的两性离子为：Ala-Ala-(Lys+)-(Ala-)，那么多肽的等电点就是正好跨过多肽的等电点的两个带电基团的pK值的一般，正好跨过多肽的等电点的两个带电基团分别是 末端NH3+  pK=8.01，ε-NH3+  pK=10.58，

所以多肽链的等电点pI=（8.01+10.58）/2=9.3.

（三）蛋白质的等电点（isoelectric point）的计算和测定方法

     一般的蛋白质的等电点计算相当复杂，少数情况下可以用线性计算方法估算，计算方法与氨基酸和多肽的等电点（isoelectric point）的计算方法相同。蛋白质的等电点可以用专业分子生物学软件估算和用等点聚焦实验加以测定。

例8. 有一个蛋白质拥有30个侧链羧基（pKa 4.3），10个咪唑基团（pKa 7.0），15个 ε-氨基（pKa 10.0）。求该蛋白质的等电点。

 解：此蛋白质有拥有30个侧链羧基（pKa 4.3），10个咪唑基团（pKa 7.0），15个 ε-氨基（pKa 10.0）。在环境pH值在高于7.0时，此蛋白质有30个负电荷，最多有25个正电荷，净剩下至少5个负电荷。所以此时不可能有此蛋白质的等电点，只有25个负电荷时才可能出现等电点，也就是4.3和7.0之间时才有可能出现此蛋白质的等电点。但是此时并不能认为

pI=1/2[pKa（羧基)+pKa（咪唑基团)]=1/2（4.3 +7.0）=5.15！因为，此时还是蛋白质的30个侧链羧基（pKa 4.3）全部解离产生了30个负电荷，10个咪唑基团（pKa 7.0）和15个 ε-氨基（pKa 10.0）全部不解离而全部带有正电荷，蛋白质一共有25个正电荷，所以净剩下5个负电荷，不是等电点。

    那么怎么算？只要明确等电点低于7.0，让蛋白质带上25个正电荷，而且让30个侧链羧基（pKa 4.3）中有5个不解离（不带电荷），那么此时就是等电点了。 

    还有用Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]，而且此时只考虑30个侧链羧基（pKa 4.3）的情况即可，即：pKa= 4.3，[共轭碱]/[共轭酸]=[COO-]/[COOH]=25/5,于是有：

      pI= pH=pKa+lg[共轭碱]/[共轭酸]

      pI= pH=pKa+lg[COO-]/[COOH]

      pI= pH=4.3+lg25/5

      pI= pH=4.3+lg5

      pI= pH=4.3+0.698970

      pI= pH=4.99897

      此蛋白质的等电点约等于5.0。

   可参考：张来群、谢立涛、李宏 主编，生物化学习题集，科学出版社，2002，第二版，P21，（五）问答及计算题-7.

蛋白质的等电点可以用专业分子生物学软件估算和用等点聚焦实验加以测定，可以参考：刘旭光、张杰，分子生物学软件应用，北京大学医学出版社，2007，第152-154页，DNAstar，ANTHEPROT等软件都可以对于蛋白质进行滴定曲线和等电点的理论预测；还有许多生物软件和网上软件都可计算出pI.例如expasy服务器就提供如此服务，把氨基酸序列输入就可以看到了：
   http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.htm

另外用序列分析软件vector NTI就可以在蛋白质数据库中搜索蛋白质的滴定曲线和等电点的相应信息，输入蛋白序列，点击序列属性窗口的analysis，其中的isoelectric point 就显示等电点。